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诺如病毒GI型和GII型通用qRT-PCR试剂盒(染料法)图片
产品货号:
BTN14-24860
中文名称:
诺如病毒GI型和GII型通用qRT-PCR试剂盒(染料法)
英文名称:
Norwalk Viruses GI/GII Universal SYBR qRT-PCR Kit
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本公司基于q PCR原理开发了本产品。


诺如病毒,又称诺瓦克病毒Norwalk Viruses N V)是人类杯状病毒科(Human Calicivirus HuCV)中诺如病毒(Norovirus NV)属的一种病毒。诺如病毒分5个基因组GI GV),其中只有G、G和G可以感染人,而G、GV分别感染牛和鼠。它们是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行。在中国5岁以下腹泻儿童中,诺如病毒检出率为15%左右血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。我国目前最常见的诺如病毒为G、G型。


  1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分包括引物和对照。
  2. 根据诺如病毒GI型和GII型的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。能同时扩增诺如病毒的GI和GII型。
  3. 基于染料法qRT PCR检测,灵敏度比常规RT PCR高10 1 00倍,可以达到至少1000拷贝反应。
  4. 使用一管式q R T PCR技术RT和PCR两步在一个试管内完成不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
  5. 本产品足够50次2 0μL体系的RT PCR只能用于科研不能用于临床。



组分规格
2×qRT-PCR缓冲液500μL
10×qRT-PCR酶混合液100μL
ROX染料I,50×20μL
ROX染料II,50×20μL
荧光PCR专用模板稀释液1mL
诺如病毒GI型和GII型通用染料法qRT-PCR引物混合液100μL
诺如病毒GI型和GII型通用染料法qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)50μL

保存:-20℃,有效期一年。


一、稀释阳性对照(以102~107这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。
  1. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
  2. 在7号管中加入5μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  3. 换枪头,在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  4. 换枪头,在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。


二、样品RNA的制备
  1. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×104拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
  2. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装,其使用手册可以从本公司网站www.bjbalb.com,通过搜索产品名称核酸释放剂或产品货号BTN61202下载。


三、设置RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
  1. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
  2. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):
    成分样品管
    N+2个
    RT-PCR
    阴性对照
    RT-PCR阳性对照
    (2~7管)
    2×qRT-PCR缓冲液10μL10μL各10μL
    诺如病毒GI型和GII型通用染料法qRT-PCR引物混合液2μL2μL各2μL
    50×ROX(见注)0.4μL0.4μL各0.4μL
    N+2个RNA模板5.6μL不加不加
    超纯水不加5.6μL不加
    6个阳性对照稀释液不加不加各5.6μL
    10×qRT-PCR酶混合液2μL2μL2μL
    注:
    需使用ROX染料I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
    需使用ROX染料II的机型:ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene3000。
    不需要使用ROX的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
  3. 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
    过程温度时间
    RT(逆转录)50℃15~30分钟
    预变性95℃5分钟
    RT-PCR反应
    (40个循环)
    95℃15秒
    60℃15秒(采集FAM通道的荧光信号)


四、数据处理
  1. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。
  2. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35~40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。




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